足细胞损伤的诱导途径：血管紧张素Ⅱ-足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6信号通路

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.46.014

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (46): 7447-7451.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.46.014

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足细胞损伤的诱导途径：血管紧张素Ⅱ-足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6信号通路

姚丹丹，马瑞霞，翟丽慧，李作林，李臻

青岛大学附属医院肾内科，山东省青岛市 266100

修回日期:2014-10-22 出版日期:2014-11-12 发布日期:2014-11-12
通讯作者: 马瑞霞，博士，副主任医师，青岛大学附属医院肾内科，山东省青岛市 266100
作者简介:姚丹丹，女，1988年生，山东省潍坊市人，汉族，2012级青岛大学附属医院肾内科在读硕士。
基金资助:
山东省自然科学基金(2012ZRB01659)，项目名称：TRPC6与糖尿病肾病足细胞损伤的关系及干预治疗研究

Angiotensin II-transient receptor potential channel C6 signaling pathway mediates podocyte injury

Yao Dan-dan, Ma Rui-xia, Zhai Li-hui, Li Zuo-lin, Li Zhen

Department of Nephrology, Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China

Revised:2014-10-22 Online:2014-11-12 Published:2014-11-12
Contact: Ma Rui-xia, M.D., Associate chief physician, Department of Nephrology, Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China
About author:Yao Dan-dan, Studying for master’s degree, Department of Nephrology, Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Shandong Province, No. 2012ZRB01659

摘要/Abstract

摘要：

背景：瞬时受体电位阳离子通道蛋白6是足细胞上一种新发现的阳离子通道蛋白，是组成裂隙隔膜重要蛋白之一，其表达变化与糖尿病肾病蛋白尿密切相关。

目的：观察高糖刺激对足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6表达的影响，探讨糖尿病肾病发生发展的可能机制。

方法：以永生化小鼠足细胞(MPC5)作为实验对象，将其设为：正常糖组(D-葡萄糖5.6 mmol/L)；渗透压对照组(D-葡萄糖5.6 mmol/L+甘露醇25 mmol/L)；高糖组(D-葡萄糖30 mmol/L)；缬沙坦组(D-葡萄糖 30 mmol/L+10^-⁵mol/L缬沙坦)；高糖+U73122组(D-葡萄糖30 mmol/L+10 μmol/L磷脂酶抑制剂U73122)。各组细胞干预时间为48 h。采用荧光定量PCR和western-blot方法检测各组足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6、nephrin、血管紧张素ⅡmRNA和蛋白的表达。

结果与结论：与正常糖组相比，高糖组足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6、血管紧张素Ⅱ蛋白及mRNA水平明显升高(P < 0.01)，nephrin mRNA及蛋白水平明显降低(P < 0.01)；与高糖组相比，缬沙坦组瞬时受体电位阳离子通道蛋白6、血管紧张素Ⅱ的表达显著降低(P < 0.05，P < 0.01)；高糖+U73122组瞬时受体电位阳离子通道蛋白6、血管紧张素Ⅱ表达较高糖组明显下降(P < 0.05，P < 0.01)；渗透压对照组与正常糖组之间各因子差异无显著性意义(P > 0.05)。结果说明高糖可能通过血管紧张素Ⅱ-瞬时受体电位阳离子通道蛋白6反馈信号通路损伤足细胞，同时也为血管紧张素受体拮抗剂通过此通路保护足细胞而治疗糖尿病肾病的提供了一新的理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 血管紧张素Ⅱ, 足细胞, 高糖, 足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(TRPC6) , nephrin, 血管紧张素抑制剂, 糖尿病肾病, 蛋白尿, 高渗, U73122, 山东省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Transient receptor potential channel C6 (TRPC6) is a new and important slit diaphragm-associated protein in podocytes involved in regulating glomerular filter function. Glomerular TRPC6 expression is closely associated with proteinuria in diabetic kidney disease.

OBJECTIVE: To investigate the expression of canonical TRPC6 in mouse podocytes induced by high glucose, and to explore the possible mechanism of diabetic kidney disease.

METHODS: Mouse podocyte cells were cultured and divided into normal glucose group (5.6 mmol/L D-glucose), normal control group (5.6 mmol/L D-glucose+25 mmol/L mannitol) and experimental groups which were in the environment of high glucose (30 mmol/L). The experimental groups included high glucose group, valsartan treatment groups (10^-⁵ mol/L) and U73122 control group (10 μmol/L U73122). After 48 hours, the expressions of mRNA and proteins of TRPC6, nephrin and angiotensin II (AngII) were detected respectively by real-time quantitative PCR and western blot analysis.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the normal control group, the expressions of mRNA and proteins of TRPC6 and angiotensin II were markedly elevated in the high glucose group (P < 0.01), while the expressions of mRNA and proteins of nephrin were decreased (P < 0.01). The mRNA and proteins of TRPC6 and angiotensin II expressions were significantly down-regulated by valsartan (P < 0.05, P < 0.01), while the mRNA and protein expressions of nephrin were effectively up-regulated (P < 0.05). Compared with the high glucose group, the expressions of mRNA and proteins of TRPC6 and angiotensin II were ameliorated in the U73122 control group. The expressions of mRNA and proteins of TRPC6, nephrin and angiotensin II had no statistical significance between the normal control group and normal glucose group (P > 0.05). Angiotensin II-TRPC6 signaling pathway may mediate high glucose-induced podocyte injury, meanwhile it provides a new theoretical basis for the treatment of diabetic kidney disease, by which the angiotensin receptor blockers can protect podocytes in diabetic kidney disease.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: angiotensin II, podocytes, diabetes mellitus, TRPC cation channels

中图分类号:

R318

姚丹丹，马瑞霞，翟丽慧，李作林，李臻. 足细胞损伤的诱导途径：血管紧张素Ⅱ-足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(46): 7447-7451.

Yao Dan-dan, Ma Rui-xia, Zhai Li-hui, Li Zuo-lin, Li Zhen. Angiotensin II-transient receptor potential channel C6 signaling pathway mediates podocyte injury [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(46): 7447-7451.

图/表（结果） 1

2.1 各组足细胞nephrin、TRPC6 mRNA表达

2.1.1 高糖对足细胞nephrin mRNA表达的影响与正常糖组相比，高糖组nephrin mRNA的表达量显著下降(P < 0.01)；渗透压对照组nephrin与正常糖组相比差异无显著性意义(P > 0.05)。见图1A。

2.1.2 高糖对足细胞TRPC6 mRNA表达的影响与正常糖组比较，高糖组TRPC6 mRNA表达量显著增加(P < 0.01)。见图1B。

2.1.3 血管紧张素受体阻断剂对高糖环境下足细胞 nephrin、TRPC6 mRNA表达的影响与高糖组相比，缬沙坦可以上调nephrin mRNA的表达，抑制TRPC6 mRNA 表达，差异有显著性意义(P < 0.05)。见图1A，B。

2.1.4 U73122对高糖环境下足细胞TRPC6 mRNA表达的影响与高糖组相比，高糖+U73122组TRPC6 mRNA表达显著下降(P < 0.05)。见图1B。

2.2 各组足细胞nephrin、血管紧张素Ⅱ、TRPC6蛋白表达的影响 Western blot检测结果见图1C。

2.2.1 高糖对足细胞nephrin蛋白表达的影响与PCR 结果一致，高糖组nephrin蛋白的表达量较正常组显著下降 (P < 0.01)；渗透压对照组nephrin蛋白表达量与正常组相比无显著性差异(P > 0.05)。见图2A。

2.2.2 高糖对足细胞血管紧张素Ⅱ、TRPC6蛋白表达的影响与正常组相比，高糖组血管紧张素Ⅱ、TRPC6蛋白表达量显著上调(P < 0.01)；高糖+U73122组血管紧张素Ⅱ、TRPC6表达较高糖组显著下降(P < 0.01)。渗透压对照组血管紧张素Ⅱ、TRPC6蛋白表达量与正常组相比差异无显著性意义(P > 0.05)。见图2B，C。

2.2.3 血管紧张素受体阻断剂对高糖环境下足细胞血管紧张素Ⅱ、nephrin、TRPC6蛋白表达的影响与高糖组相比，缬沙坦组nephrin蛋白表达量升高，而血管紧张素Ⅱ、TRPC6蛋白表达降低，差异有显著性意义(P < 0.01)。见图2A-C。

2.2.4 U73122对高糖环境下足细胞血管紧张素Ⅱ、TRPC6蛋白表达的影响与高糖组相比，U73122治疗组血管紧张素Ⅱ、TRPC6蛋白表达降低，差异有显著性意义 (P < 0.01)。见图2 A-C。

参考文献

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引言

糖尿病肾病是导致终末期肾脏病的主要原因之一。预计至2030年，全球糖尿病患者将增加至4 390 000^[1]，同时糖尿病肾病患者也将相对增多。糖尿病肾病发生发展过程中的早期表现之一为微量白蛋白尿^[2]，其发生主要是肾小球滤过屏障的损害引起。肾小球滤过屏障由毛细血管内皮细胞、基底膜和足细胞的足突组成。足细胞是高度分化的细胞，其足突相互交错对插，构成滤过膜的最后一道屏障。

目前已经证实nephrin、podocin、CD2相关蛋白等均表达于足细胞，相互关联，共同参与裂隙隔膜的组成^[3-9]。其中任何一种蛋白的突变都可引起肾脏的损伤：nephrin最早发现足细胞裂隙膜的主要成分，是一种跨膜蛋白，可调节足细胞骨架重排，其作用是防止蛋白质漏出，nephrin、podocin、CD2受体蛋白损伤后即可出现蛋白尿。因此足细胞的正常结构对维持肾脏的正常功能有着极其重要的作用。

最近研究发现一种存在于肾脏足细胞裂孔隔膜的新蛋白-瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(transient receptor potential cation channel 6，TRPC6)，它是一种非选择性阳离子通道，是瞬时受体(TRP)家族的主要成员之一，2005年，Winn等^[3]第一次报道TRPC6通道位于肾小球足细胞，属于裂孔隔膜蛋白，免疫共沉淀研究也证实了TRPC6与裂隙膜蛋白nephrin和podocin相关，提示TRPC6参与裂隙膜上的信号转导^[4^，^10]。裂隙膜复合物在结构上和功能上与细胞骨架肌动蛋白连接，足突消失可能引起细胞骨架的重排，而足突消失是引发蛋白尿的主要机制。此外，在人类获得性蛋白尿的肾脏疾病中，包括非家族性局灶阶段性和膜性肾病中，TRPC6在肾小球上的表达是升高的。Reiser等^[4]还发现小鼠被TRPC6高表达质粒转染后，会引起蛋白尿的发生。TRPC6通过介导钙离子内流而发挥病理生理作用^[11]，钙离子内流增加可能导致细胞膜表面的TRPC6通道开放增加，或者增加该通道活性引起足细胞结构的完整性的破坏，从而导致蛋白尿。

血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是肾小球疾病的发病机制中是重要的因素之一，高糖环境下血管紧张素原上调，刺激足细胞血管紧张素Ⅱ大量合成，直接损害肾脏最终导致糖尿病肾病的发病^[12]，并且Njenhuis等^[13]研究发现AngII-TRPC6信号通路参与肾炎模型中足细胞的损伤。但糖尿病肾病时血管紧张素Ⅱ与TRPC6的关系目前国内外报道甚少。本实验采用TRPC6 为切入点，观察高糖刺激下足细胞TRPC6、血管紧张素Ⅱ表达的变化，并进一步给予缬沙坦处理高糖作用下的足细胞，观察上述因子的表达变化，探讨高糖作用下血管紧张素Ⅱ与 TRPC6 的关系。

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材料方法

设计：实验细胞观察。

时间及地点：实验于2013年11月至2014年3月在山东省青医附院中心实验室完成。

材料：MPC5细胞株由山东大学药理实验室培育；缬沙坦为北京诺华制药有限公司产品；磷脂酶抑制剂U73122为美国Cayman公司产品；羊抗TRPC6多克隆抗体及羊抗血管紧张素Ⅱ多克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品；HRP标记的兔抗山羊IgG为北京中杉金桥生物公司产品。

实验方法：

细胞培养：首先复苏细胞，置于含γ-干扰素的RPMI-1640培养液中，于33 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中促进其增殖；待细胞融合至80%时传代至不含γ-干扰素的培养液中，于37 ℃培养箱中诱导分化14 d至足细胞分化成熟。

实验分组：根据实验目的将足细胞分成6组：①正常糖组(D-葡萄糖5.6 mmol/L)。②渗透压对照组(D-葡萄糖 5.6 mmol/L+甘露醇25 mmol/L)。③高糖组(D-葡萄糖 30 mmol/L)。④缬沙坦组(D-葡萄糖30 mmol/L+10^-⁵ mol/L 缬沙坦)。⑤高糖+U73122组(D-葡萄糖30 mmol/L+ 10 μmol/L U73122)。分别孵育48 h，用荧光定量PCR、western-blot测定TRPC6、血管紧张素Ⅱ及nephrin的表达。

荧光定量PCR法检测各组足细胞TRPC6、nephrin mRNA表达：Trizol法提取足细胞中的总RNA，用紫外分光光度计测定总RNA样品的浓度，根据结果加入适量DEPC 水调整RNA浓度；在冰上按说明书配制反转录反应液 10 μL，PCR反应液20 μL，进行反应。

反应结束后，记录各产物的Ct值及各基因的Tm值， 84.3 ℃，84.2 ℃，82.4 ℃分别为TRPC6、GAPDH、nephrin的Tm值，采用Ct值法对基因表达产物进行相对分析。

Western blot检测各组足细胞TRPC6、AngⅡ、nephrin 蛋白表达：提取细胞总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，95 ℃加热变性，-20 ℃保存备用；室温解冻蛋白，配置分离胶及浓缩胶；添加蛋白样品及Marker至胶孔后进行电泳，转膜、封闭；4 ℃孵育TRPC6、血管紧张素Ⅱ、nephrin抗体及内参GAPDH抗体过夜，洗膜，常温孵育兔抗羊二抗1 h，洗膜。将ECL试剂盒A液B液配好的200 μL滴在保鲜膜上，将PVDF膜的蛋白面贴在液面上，放入化学发光成像仪中曝光。用Quantity One图像分析软件分析每个条带的灰度值，以目的条带与内参条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

主要观察指标：各组足细胞TRPC6、血管紧张素Ⅱ、nephrin mRNA及蛋白的表达变化。

统计学分析：计量资料数据以x(_)±s表示，各组间均数比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD法。采用SPSS 19.0软件包进行分析，P < 0.05有显著性意义。

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讨论

TRPC6通道蛋白属于肾小球足细胞裂孔隔膜蛋白之一，且与裂隙膜蛋白nephrin和podocin密切相关，提示 TRPC6参与裂隙膜上的信号转导^[14]。目前在非糖尿病肾病中已发现多种信号通路参与足细胞TRPC6的调节，如激活转化生长因子β1/胞浆内蛋白(Smad3)-细胞外信号调节激酶(ERK)-NF-Кb信号通路可使足细胞TRPC6表达上调^[15]；血管内皮生长因子与配体结合激活蛋白激酶C引起足细胞TRPC6表达增加^[16]。另外在非糖尿病肾病Eckel等^[17]的研究显示血管紧张素Ⅱ可引起白蛋白尿，而在敲除小鼠 TRPC6基因后，蛋白尿明显减轻；而在糖尿病肾病中 TRPC6与血管紧张素Ⅱ作用通路鲜有报道。本实验通过探究高糖环境下TRPC6与血管紧张素Ⅱ的相关性，得出高糖可能通过AngⅡ-TRPC6反馈信号通路损伤足细胞。TRPC6为受体控制性钙离子通道，钙离子内流增加可上调其表达，诱发足细胞凋亡导致蛋白尿的发生。Roshanravan等^[11]研究发现在MPC5及大鼠足细胞中，ATP 可引起细胞外钙离子内流，导致TRPC6表达增加。TRPC6 钙通道可被二脂酰甘油(DAG)激活，它可直接作用于 TRPC6通道经由磷脂酶C依赖机制使细胞内钙离子浓度升高，从而调节TRPC6通道的活性^[18]。而U73122是磷脂酶C 抑制剂，可特异性抑制磷脂酶C，磷脂酶C的抑制可降低DAG生成，而导致钙离子内流减少，TRPC6通道的开放减少。Jiang等^[19]研究表明在TRPC6基因转染足细胞中，应用U73122拮抗钙离子内流可阻止TRPC6过度表达，减少细胞骨架重塑，减轻对足细胞的损害。同时本实验数据也显示在高糖刺激下TRPC6表达增高，而U73122可减少足细胞TRPC6表达。另外Ilatovskaya等^[20]研究发现血管紧张素Ⅱ可激活野生型足细胞钙离子内流，而对于小鼠特异性敲除TRPC6基因后，这一作用明显减弱。因此，本实验以TRPC6为切入点探讨高糖环境下血管紧张素Ⅱ对TRPC6的作用机制。

血管紧张素Ⅱ是肾素-血管紧张素(RAS)的生物活化中心，也是其主要的效应分子。近年来大量研究证实血管紧张素Ⅱ不仅通过其血流动力学改变损伤肾脏，还可通过刺激肾脏固有细胞的生长、炎症反应的发生及纤维化来引起肾脏损害。目前已有众多研究显示非高糖环境下血管紧张素Ⅱ可调节足细胞TRPC6的表达，引起肾脏损害。如Nijenhuis等^[13]用血管紧张素Ⅱ灌注Wistar大鼠，发现大鼠肾小球TRPC6的表达是增加的，同样也伴随着肾小球的进行性损害。Eckel等^[17]的研究显示血管紧张素Ⅱ可引起白蛋白尿，但是这一现象在敲除TRPC6基因的小鼠可得到明显缓解。同时也有许多学者证实在高糖环境下血管紧张素Ⅱ、TRPC6表达增多而损害肾脏。Yang等^[21]研究表明在高糖环境下，TRPC6表达增多并通过RhoA/ROCK通路促进凋亡。Somineni等^[22]指出高糖环境下血管紧张素Ⅱ表达增多，对肾脏产生损害。而高糖环境下血管紧张素Ⅱ是否可通过调控TRPC6表达损伤足细胞鲜有报道。因此，实验建立体外糖尿病肾病模型，研究高糖环境下血管紧张素Ⅱ 与TRPC6表达变化，并证实了高糖刺激可引起足细胞血管紧张素Ⅱ及TRPC6表达增加，而给予AT1R阻断剂缬沙坦后，会降低血管紧张素Ⅱ及TRPC6的表达，减少足细胞损害。由此说明在糖尿病肾病模型中高糖可以促进血管紧张素Ⅱ的表达，后者可引起TRPC6的表达增多致使足细胞受损，血管紧张素Ⅱ对TRPC6具有调控作用。另外有学者指出血管紧张素Ⅱ及其受体ATl在许多蛋白尿性的肾脏疾病(包括FSGS)的发生发展过程中起重要作用，ATl与异源三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)结合，激活磷脂酶C，水解 4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)，同时伴随产生1，4，5-r三磷酸肌醇(InsP3)，随之DAG打开钙池，钙离子内流使胞内钙离子浓度明显升高^[23-24]。在本实验中，依据TRPC6为非选择性钙离子通道和U73122可阻断钙内流特性，因此作者设置了U73122用药组也作为一实验组，结果显示：高糖可以刺激血管紧张素Ⅱ和TRPC6的表达，而应用U73122阻断钙离子通道后TRPC6表达减少，相应的血管紧张素Ⅱ的表达也是减少的。由此得出在高糖刺激下，TRPC6的表达变化也可影响血管紧张素Ⅱ的表达。

综上所述，实验结果得出高糖可通过AngII-TRPC6反馈信号通路损伤足细胞，参与糖尿病肾病的发生及发展；同时也为血管紧张素抑制剂通过此通路保护足细胞治疗糖尿病肾病的提供了一新的理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Angiotensin II-transient receptor potential channel C6 signaling pathway mediates podocyte injury

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